16s rdna测序是利用高通量测序技术对样品微生物的16s rdna扩增产物的片段进行测序，能够对特定条件下细菌种类和丰度进行有效的鉴定。16s rdna 指细菌基因组中编码核糖体16s rrna分子对应的dna序列。16s序列由9个高变区组成，中间是保守区，是最常用的细菌分类标准。通过提取环境样品的dna，扩增其中16s rdna基因，可以鉴定绝大多数细菌。基于illumina miseq平台的16s rdna测序可以一次性完成多个样本的平行测序，可以进行样品中细菌多样性、物种丰度、种群结构和系统进化等诸多信息分析。
1、实验方案
测序策略：illumina miseq pe300/pe250
数据量：推荐5万条clean reads
2、技术优势
（1）准确性高：从碱基保守水平测定，真实反映物种情况。
（2）快速高效：相比于传统鉴定方法，16s测序鉴定微生物更快速和准确。
（3）过程简单：环境样品的最优pg电子下载的解决方案，完全摆脱繁杂的菌株分离工作。
（4）灵敏度高：可以鉴定到低丰度细菌。
（5） 降低成本：需测序数据量少，检测成本低。
3、数据分析
（1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估。
（2）tags拼接、过滤
（3）物种组成分析（与rdp、silva、greengene等数据库比对）；
（4）otu统计及venn图分析
（5）otu rank曲线
（6）物种积累曲线
（7）物种注释及其丰度分析（柱状图和热图分析）
（8）物种系统进化分析
（9）单个样本复杂度分析（α多样性分析）；
（10）样本间/组间α多样性差异统计分析及盒形图；
（11）样品间复杂度分析：β多样性heatmap分析
（12）β多样性pcoa分析（2d/3d）
（13）nmds-2d/3d分析
（14）样本组间差异分析：adonis分析，相似性分析，rda/cca分析等。
（15）不同样本间物种组成聚类分析（样品数≥3）
4、技术流程
5、案例分析
案例（1）多发性硬化病与肠道微生物组的关系
肠道微生物对于免疫系统的功能发挥着重要的意义，同时与多种自身免疫疾病相关。beth isreal deaconess医疗中心的人员使用miseq和454测序仪，通过对60例ms（多发性硬化疾病）患者和43例健康人进行肠道16s rrna测序并分析，发现ms患者的肠道中methanobrevibacter和akkermansia两种菌丰度增高，同时还伴有butyricimonas的丰度降低。接受治疗后，患者肠道中prevotella和sutterella的丰度有所上升，sarcina有所降低。提示了肠道微生物的菌种改变有助于发现ms起病原因。
图1 ms患者和健康人肠道微生物的差异分析
案例（2） 红斑狼疮患者兼患牙周炎龈下牙垢16s rdna测序揭示口腔微生物的多样性
红斑狼疮是免疫系统疾病，很多患者会同时患有口腔疾病。该研究募集了52例sle患者（伴有牙周炎35例，无牙周炎17例）和52例非sle对照（伴有牙周炎28例，无牙周炎24例）；共采集104份龈下牙垢，提取总dna后，利用illumina miseq平台行16s rdna测序v4区域。sle患者牙周炎发生地更加普遍且更严重，且年龄更小。sle会影响口腔微生物的多样性。在患有牙周炎的群体中，sle患者较对照组口腔微生物多样性低。微生物的相互关系分析中，非sle对照样本共鉴定到89个细菌关联，而sle患者样本中共发现了111个细菌关联。
图1 对照组（红色）和非牙周炎sle样本（绿色）具有不同相对丰度的otu
参考文献
[1] jangi et al. alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. nature communications, 2016.
[2] corrêa et al. subgingival microbiota dysbiosis in systemic lupus erythematosus: association with periodontal status. microbiome, 2017.
