(1)技术原理
串联亲和纯化(tandem affinity purification, tap)技术基本原理包括:重组构建带有两种亲和纯化标签的融合靶蛋白,然后转染到宿主细胞或组织,带标签的靶蛋白表达并结合上相关蛋白质后,利用标签与相应磁珠作用,两步纯化得到相关蛋白质。tap技术联合质谱对纯化后的蛋白质进行分析,通过生物信息学获得的蛋白相关性可信度高,为后续的验证工作节省大量时间。
(2)技术应用
tap与质谱技术联用已成为一种高效且实用的方法,在生物大分子相互作用领域中被广泛应用。近些年,随着tap标签的全面改进和质谱技术的不断发展,tap-ms的灵敏度与专一性得到很大提高,使得该技术得以在更多领域发挥重要作用,也使得我们对蛋白质复合体进行系统性研究成为可能。
【服务内容】
构建融合flag-ha的诱饵蛋白真核表达载体或者慢病毒载体;载体瞬时转染靶细胞或包装慢病毒感染靶细胞;tap纯化互作蛋白;质谱鉴定互作蛋白。
【客户须知及标本要求】
(1)客户须明确检测目的和具体要求,最好能提供1~2篇文献或资料。
(2)sds-page条带:考染,条带清晰可见;蛋白质溶液:蛋白质总量>5μg/μl。
(3)蛋白洗脱液:定量并计算总蛋白量,真空干燥后,密封好管口,冰袋包装寄送。
(4)蛋白质条带(考染):从凝胶上割取条带时,避免污染,将条带放入ep管内,密封好管口,冰袋包装寄送。